La cloroquina 63

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El tratamiento con cloroquina de las células ARPE-19 conduce a la dilatación lisosoma y la acumulación intracelular de lípidos: posibles consecuencias de la disfunción lisosomal en la degeneración macular fondo la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la causa más frecuente de ceguera en las personas de edad avanzada mayores de 60. La patogénesis es aún poco claro. Se ha sugerido que el estrés lisosomal puede conducir a la formación de drusas, un biomarcador de AMD. En este estudio, ARPE-19 células se trataron con cloroquina para inhibir la función lisosomal. Resultados células ARPE-19 Cloroquina tratados demuestran un aumento marcado en la vacuolización y escombros intracelular denso. Estos son identificados como los lisosomas cloroquina dilatada y cuerpos lipídicos con LAMP-2 y LipidTOX co-localización, respectivamente. La dilatación es un indicador de la disfunción lisosomal. La cloroquina interrumpe la absorción aplicada de forma exógena dextrano marcado con rodamina por estas células. Esto sugiere una alteración en la vía fagocítica. El aumento en los niveles de proteína LAMP, según la evaluación de las transferencias Western, sugiere la posible participación en la autofagia. El estrés oxidativo con H 2 O 2 no induce vacuolización o la acumulación de lípidos. Conclusión Estos hallazgos sugieren un posible papel de los lisosomas en AMD. El tratamiento con cloroquina de las células del EPR puede ayudar a comprender los mecanismos celulares subyacentes AMD. Antecedentes relacionada con la edad degeneración macular (AMD) es la causa principal de la pérdida progresiva de la visión central en personas de edad avanzada mayores de 60 1 3. Las características clínicas de la AMD seca, que representa el 85-90 de los pacientes con AMD, es la aparición de pigmentos amarillos conocidos como drusas y la muerte de los fotorreceptores marcada dentro de la mácula 1. 4. Si bien se ha establecido que el tabaquismo, exposición a la luz y la genética son factores de riesgo de AMD, su patogénesis celular-molecular sigue siendo poco clara 4. metabolismo del epitelio pigmentario de la retina (EPR) es un factor importante en la acumulación de drusas a lo largo de la membrana Bruchs, situada estratégicamente entre la coroides y RPE 4. El RPE, un epitelio monocapa altamente especializado que forma la capa más externa de la retina, está entre los sistemas fagocíticas más activos en el cuerpo 5. 6. Sobre una base diaria, las puntas segmento externo de fotorreceptores son fagocitados en el RPE, y se digirieron en fago-lisosomas dentro del RPE 7. La autofagia también contribuye a la pesada carga de material del EPR digiere 8. En teoría, la sobrecarga lisosomal puede por lo tanto dar lugar a una acumulación de residuos biológicos, lo que reduce la eficiencia del EPR y contribuyendo a los depósitos de proteína-lípido extracelular a lo largo de la membrana Bruchs 4. 8 10. sobrecarga lisosomal y la disfunción en el RPE se sospecha que es una causa fundamental y principios de AMD 4. 11. Está bien establecido que la lipofuscina, un agregado pigmentada de proteínas y lípidos, un componente primario de drusas, y un biomarcador AMD, está retenido por los lisosomas en RPE 12. 13. En concentraciones críticas, N-retinylidene-N - retinylethanolamine (A2-E), un pigmento fluorescente de la lipofuscina, inhibe la bomba de protones ATPasa lisosomal, inhibe enzimas críticas y provoca fugas compartimento lisosomal en el citoplasma RPE 4. 14. 15. Recientemente, se ha demostrado que la mutación variante B en la cistatina C, un inhibidor de proteasa lisosomal ampliamente expresado, inhibe la secreción de regulador proteolítica, la señalización mistargets, provoca retención de la proteína celular inadecuada y se asocia con AMD y Alzheimers 16. Además, las proteínas modificadas por la peroxidación de lípidos similares a los encontrados en la lipofuscina se ha demostrado para reducir la actividad proteolítica de los lisosomas de las células del EPR 17. Por último, los estudios han comenzado a descubrir una relación entre la degeneración de la retina y el tipo de Niemann-Pick C, una conocida enfermedad de almacenamiento lisosomal. Un estudio reciente observó que los ratones con mutaciones en el gen NPC1 y NPC2, que transcriben proteínas que median la salida de las lipoproteínas de lisosomas, demuestran golpear degeneración de la retina, la regulación positiva de la autofagia y marcada acumulación de lipofuscina en el RPE 18. Estos estudios anteriormente mencionados sugieren que las anormalidades en la actividad enzimática y la integridad estructural de los lisosomas de las células del RPE pueden desempeñar un papel en la patogénesis de la AMD. En este estudio, se investiga el posible papel de los lisosomas en AMD por tratamiento de células in vitro adultas humanas de retina pigmentadas epitelio-19 (ARPE-19), que previamente se han utilizado como modelo para el estudio de la etiología y el desarrollo de AMD 19 . 20, con cloroquina, un agente lysosomotropic conocido. Los efectos de la cloroquina como agente retinopathic, como se observa por la disfunción lisosomal y la degradación de RPE, se han demostrado en varios modelos animales 21 24. Utilizamos la capacidad de la cloroquina para aumentar el pH 25 tanto de entender los efectos generales de la cloroquina en ARPE-19, y como modelo para la inhibición lisosomal. Los resultados demuestran que la cloroquina induce la formación de vacuolas, la muerte celular, la acumulación de lípidos citosólica y la disminución de la absorción de dextrano exógena en ARPE-19. Resultados ARPE-19 lisosomal La inhibición con cloroquina tratamiento con cloroquina es un agente lysosomotropic sabido que aumenta el pH lisosomal mediante la acumulación dentro de los lisosomas como una base débil desprotonado. Para estudiar los efectos de la disfunción lisosomal en ARPE-19, fue necesario establecer un cloroquina utilización de modelo in vitro. Se determinó la concentración de cloroquina que cambió sustancialmente la actividad lisosomal, pero no dio lugar a la necrosis celular. Para encontrar una concentración óptima de cloroquina que no afectó a ARPE-19 la viabilidad celular, se utilizó tanto DAPI tinción núcleos y el ensayo MTT (Figura 1). Para la cuantificación de células DAPI, se contaron los núcleos de diez áreas aleatorias de la cubreobjetos. Los resultados (no mostrados) de estos recuentos se promediaron, expresados ​​como el porcentaje del control, y se analizaron mediante prueba t de Student y ANOVA de una vía con un TI-89 Texas Instruments calculadora gráfica. El análisis DAPI mostró la viabilidad celular era el momento y la dosis dependiente, con concentraciones de 10-20 g / ml a las 24 horas de incubación períodos no significativamente (P 0,05, n 6) afectada. La viabilidad celular de ensayo. ensayo de MTT muestra toxicidad cloroquina es a la vez tiempo y dependiente de la dosis. concentraciones de cloroquina de 10-30 g / ml (p 0,05) no afectan significativamente la viabilidad celular. El ensayo MTT, que evaluó la proliferación celular mediante la medición de la actividad metabólica, mostró resultados similares. La Figura 1 demuestra que la viabilidad celular y el metabolismo es relativamente poco afectada 10-30 g / ml y es dosis dependiente. Prueba t de Student no muestra diferencias significativas 10-20 g / ml (p 0,05, n 6). Induce la cloroquina Citosólica vacuolización y densa formación de cuerpos de haber decidido que las concentraciones bajas (10-20 g / ml) a las 24 horas de incubación no redujeron significativamente la viabilidad, se evaluaron los cambios celulares citoplasmáticos en células ARPE-19 con un microscopio de contraste de fase. Figura 2 muestra la progresión de los cambios citoplasmáticos de ARPE-19 tratadas con cloroquina bajo microscopía de contraste de fase. Se encontró que el 10-20 g / ml de cloroquina inducida marcada vacuolización dentro del citoplasma de las células ARPE-19, como puede verse en la figura 3. Además del aumento de tamaño de la vacuola y la dispersión, se observa la aparición de densas formaciones negras, circulares, intercaladas por todo el citoplasma y alrededor de las grandes vacuolas. Vacuola y el tamaño del cuerpo denso aumentaron con la dosis de cloroquina. En un estudio paralelo realizado en células NIH 3T3, se pudo comprobar la dilatación de los lisosomas en concentraciones similares de tratamiento con cloroquina (Figura 4). Sin embargo, no hubo desarrollo simultáneo de las densas formaciones, negro. Los cambios citoplasmáticos con cloroquina en ARPE-19. Fase microscopía de contraste de ARPE-19 con 0 (A), 10 (B), 20 (C), 40 (D), 80 (E) g / ml de cloroquina. El tratamiento con cloroquina hace que vacuolas rodeados de membrana (flechas rojas) y cuerpos densos membranosas (flechas azules). ARPE tratados con altas dosis de cloroquina mostrar signos de muerte celular. tamaño de la barra 25 micras. Co-localización de LAMP-2 y LipidTOX. (A-D) Control de ARPE-19. (E-H) 20 g / ml de cloroquina tratados con células ARPE-19. contraste de fase de control (A) no muestra vacuolización y LAMP-2 (B, verde), y se observa LipidTOX (C, rojo) a lo largo de tinción celular. D es superposición fluorescente. células tratadas con cloroquina en contraste de fases (E) muestra vacuolización intensa (flechas blancas). Estas vacuolas co-localizar con LAMP-2 tinción (F, flechas blancas correspondiente). El tratamiento con cloroquina también induce la formación de cuerpo denso (E, flechas amarillas). formaciones densas co-localizar con lípidos neutros (G, flechas amarillas correspondiente). Superposición (H) no muestra ningún solapamiento entre los lípidos y las vacuolas. tamaño de la barra 25 micras. Co-localización de LAMP-1 en células NIH / 3T3. células NIH / 3T3 muestran un patrón similar de formación de vacuolas con el tratamiento de la cloroquina. contraste de fase y correspondiente LAMP-1 co-localización de 25 g / ml células cloroquina tratados con (C, D) muestran vacuolización de LAMP-1, en comparación con el control (A, B). Las flechas en C y D nota que las fronteras de las vacuolas se corresponden con la proteína LAMP-1. tamaño de la barra 25 micras. localiza Co-con Dilated Las vacuolas, LipidTOX Co localiza-con formaciones densas para determinar si las vacuolas anormales estaban dilatadas lisosomas, como está documentado en un estudio anterior utilizando EPR pantorrilla 26, y si los cuerpos densos contienen lípidos, células ARPE-19 LAMP-2 se duplicaron teñido con LAMP-2 de anticuerpos y LipidTOX de lípidos neutros. La inhibición de la catepsina proteasa lisosomal esencial B y otros mucopolisacáridos es característico de los lisosomas cloroquina dilatada 25. Por otra parte, los lípidos co-localización sugeriría una forma de acumulación de escombros biológica intracelular dentro de la célula en respuesta a la inhibición enzimática lisosomal. LAMP-2 tinción de anticuerpos de las células tratadas con cloroquina se utilizó para co-localizar vacuolas dilatadas con los lisosomas y complejos de fago-lisosomal. Como se muestra en la Figura 3 LAMP-2 tinción de anticuerpos co-localiza con membranas de vacuolas dilatadas. No se observó diferencia notable en la intensidad de la tinción de anticuerpos entre el control y células tratadas con cloroquina. LipidTOX tinción localizada en la zona perinuclear y periférico de la célula. La Figura 3 muestra co-localización de cuerpos densos con LipidTOX, especialmente en la periferia de las células. Como control para la tinción no específica, las células se lavaron con Triton no mostraron tinción LipidTOX. La cloroquina no causó cambios morfológicos en el aparato de Golgi o mitocondrias (Figura 5). La figura 5 no muestra co-localización, y no hubo una disminución marcada en la tinción mitocondrial entre el control y 10-20 g / ml tratamiento con cloroquina. Parece que los lípidos co-localizada pueden representar restos intracelular, la consecuencia de los lisosomas disfuncionales. Efecto cloroquina en ARPE-19 de Golgi y mitocondrias. (A-D) Las mitocondrias co-localización en el control (A-B) y (C-D) 20 g / tratados ml ARPE-19. No hay diferencia en MitoTracker tinción (rojo) intensidad, la forma o la localización entre el control (B) y el tratamiento (D). Del mismo modo, no hubo cambios notables en el aparato de Golgi (E-H). Golgi co-localización de control (E-F) y 20 tratamientos g / ml de cloroquina. Golgi se tiñe con golgin-97 tinción de anticuerpos (verde). tamaño de la barra 25 micras. ARPE-19 fagocítica Pathway es interrumpido por cloroquina Utilizamos Western Blot de LAMP-1 y 2 (Figura 6A) y exógena dextrano marcado con rodamina (Figura 6B) para observar la interrupción de autophagic cloroquina tratados y las vías fagocíticas, respectivamente. Si la función fagocítica es normal, los niveles de LAMP-1 y LAMP-2 de proteínas deben permanecer relativamente igual a pesar del tratamiento con cloroquina. examen cuantitativo de las transferencias de Western se realizó por densitometría 27 (ImageJ software, disponible en http://rsb. info. nih. gov/ij/). transferencias de Western de la Figura 6 muestran una marcada aumento de LAMP-1 en las células tratadas con cloroquina, especialmente a 10 g / ml. LAMP-2 muestra una tendencia similar, aunque menos drástica regulación al alza. Actividad fagocítica y Proteína LAMP. Las comparaciones (A) de los niveles de proteína LAMP-2 LAMP-1 y a diferentes concentraciones de cloroquina. Los niveles de proteína medidos en ARPE-19 por Western blot con el beta-actina como control de carga. espectáculos occidentales marcados aumento cualitativo en LAMPARA 1-2 tamaño de la banda entre el control y 10 g / ml tratamiento con cloroquina, mientras que el control de carga es constante. (B) No hay un aumento significativo de LAMP-1 y 2 (p 0,05) a 10 g / ml con la respuesta general tendencia upregulation al tratamiento con cloroquina. Inmunotransferencias (n 6) fueron escaneados, y densitometría se realizó en bandas con ImageJ (NIH, Bethesda MD). medición de la densidad de banda relativa se repitió varias veces para garantizar que los valores máximos y mínimos. Exógenos dextrano marcado con rodamina se aplicó a las células a la cloroquina tratada. Se aprecia una disminución notable en dextrano intracelular en células cloroquina tratados (Figura 7A). retención de dextrano y la absorción se cuantificó mediante la comparación de maximas relativas con ImageJ. Hay una disminución significativa en dextrano intracelular entre el control y / tratamiento ml 10 g (Figura 7B). Estos hallazgos sugieren o bien aumentaron exocitosis o disminución de la absorción de fagocitosis. Actividad fagocítica Medido por dextrano captación. (A-B) La inmunofluorescencia exógena de dextrano marcado con rodamina (rojo) la absorción con marcas ImageJ (retículos) de maximas de dextrano contados. 20 g / ml de cloroquina células tratadas en 24 horas (B) mostraron sorprendente disminución en la captación de dextrano fluorescente en comparación con el control (A). (C) La cuantificación de la captación de dextrano entre el control y la cloroquina tratada ARPE-19. Hay una (p 0,05) disminución significativa en la absorción de dextrano relativa en células ARPE-19 incluidas en la muestra entre el control y células tratadas con cloroquina. La cuantificación se realizó usando ImageJ, las células del mismo tamaño relativo (20-25 micras) aislar, y luego calculando maximas fluorescentes (tolerancia 20, basado en el control). Maximas fueron promediados y se realizó la prueba t estándar (n 10). H 2 O 2 Prueba de Estrés oxidativo El estrés oxidativo es una de las causas principales de AMD, y se sospecha como catalizador primario de la enfermedad 28. Hemos investigado si se produce la acumulación de lípidos intracelular en la misma medida en las células ARPE tratados con H 2 O 2. Sin citoplasmática densa agregada formación o la dilatación lisosomal se produjo en H 2 O 2 tratado con células bajo contraste de fases (Figura 8). No hubo diferencias notables en los patrones de tinción co-localización LipidTOX LAMP-2 y en el control y H 2 O 2 tratados con células ARPE-19. Esto sugiere que la acumulación de lípidos antes mencionado en ARPE-19 observada con el tratamiento con cloroquina se acelera por la alteración inducida en función lisosomal, y no secundaria a estrés oxidativo. Prueba de estrés oxidativo. (A) de contraste de fases, (B) LAMP-2 y (C) la tinción de LipidTOX de ARPE-19 tratada con peróxido de hidrógeno 10 mM. (D) de superposición que muestra co-localización de lípido neutro y LAMP-2. No existen diferencias en el citoplasma celular (vacuolas, lípidos) en fase o de fluorescencia entre el control (Fig 2 A-D) y tratamiento con peróxido de hidrógeno. Discusión Los mecanismos moleculares por los que las drusas y AMD desarrollan no se comprenden claramente en este momento. Las drusas se ha postulado que es la combinación de estrés oxidativo, lipofuscina y la capacidad de sobrecarga lisosómica POS 4. A continuación, se investiga el posible papel de un mal funcionamiento lisosomal en la DMAE mediante el examen de los efectos de la cloroquina, un agente lysosomotropic, en células ARPE-19. Nuestros hallazgos detalle una curva de toxicidad de dosis-tiempo, marcada vacuolización en el citoplasma, la acumulación de los desechos intracelular, y una alteración de las vías fagocíticas en la cloroquina tratada ARPE-19. La cloroquina resultó ser un apartamento modelo in vitro para observar la acumulación de lípidos intracelulares en células ARPE-19. La cloroquina inducida intensa vacuolización de las células. Una observación similar se ha observado recientemente en condiciones similares 29 y en el RPE bovina en condiciones ligeramente las condiciones de hipoxia 23. Vacuolización se ha demostrado como un indicador de la acidificación alterada a través de un mecanismo de protones de captura 25 y la inhibición de las enzimas lisosomales clave, incluyendo la catepsina D 30. Esto es consistente con los resultados in vivo que han demostrado que el envejecimiento de la retina se ha asociado con una disminución en glicosidasas lisosomales y regulación a la baja de la catepsina D 31. Además, confirmamos la validez de la dilatación, y la inhibición inducida por tanto, de fago-lisosomas, por el éxito de co-localización con LAMP-2. Quizás el hallazgo más sorprendente fue la co-localización de acumulación densa formación con la tinción de lípidos. La falta de cuerpos densos en células 3T3 (Figura 4) sugiere que este fenómeno puede ser única para las células del epitelio retinal. células del EPR por la naturaleza de su función de fagocitar POS es probable que sean más dependientes de la actividad lisosomal. Las aberraciones en esta actividad pueden conducir a la acumulación de los cuerpos lipídicos que en última instancia pueden contribuir a la formación de drusas. Finalmente, en contraste con la bien establecida teoría mitocondrial del eje 32, se encontró que la acumulación de lípidos, inducida por cloroquina, no se ve con un modelo de estrés oxidativo (Figura 8), que es, posiblemente, sólo un factor secundario. Curiosamente, el aumento de los niveles de LAMP-1 y 2 de proteínas, así como una disminución de retención / absorción de dextrano exógeno, sugieren que las alteraciones en la vía de fagocitosis se producen después de la inhibición lisosomal por cloroquina. La regulación positiva de la lámpara podrían indicar un número de cambios intracelulares. Podría ser un reflejo de un aumento general de tamaño de superficie de membrana lisosomal debido a la dilatación, o un aumento general en los lisosomas. Además, se puede indicar una regulación por incremento compensatorio en la fusión fagosoma y el movimiento 33-lisosomal. Es posible que el aumento sorprendente en LAMP-1 es una indicación de la aparición de la apoptosis, una observación observó en células de glioblastoma en cultivo 34. Por el contrario, no parece cloroquina a dosis bajas para inducir el aumento de la autofagia, como vacuolización autofagia-asociado se correlaciona con una disminución de los niveles de LAMP-2 35. En el momento de la publicación, hemos iniciado estudios sobre siRNA desmontables de la proteína LAMP eludicate el mecanismo de estos cambios en las proteínas a la luz de vacuolización. Nuestros hallazgos sugieren dextrano exógenas o bien una falta de retención intracelular o el aumento de la exocitosis debido a la inhibición lisosomal. Hay un gran debate sobre los mecanismos que se produce en la DMAE. Existe la creencia de que la combinación de estrés oxidativo y una disminución de ATP impulsa la exocitosis de las proteínas intracelulares parcialmente digeridos en la membrana Bruchs 8. Sin embargo, estudios recientes han investigado el papel de las mutaciones ABCA4 transportadoras en la reducción de movimiento de los lípidos oxidados en Stargardts AMD 36. Del mismo modo, se ha demostrado que los lípidos-proteínas oxidadas pueden bloquear la formación de fagosoma, y ​​por lo tanto impedir la internalización en RPE 37. Otro candidato para la causa de la disfunción lisosomal en las células es la degradación de la glycocalyx, que protege a la proteína de membrana LAMP-2 vital. Aunque la función exacta de LAMP-2 todavía no está claro, se ha propuesto que es responsable para equilibrar los niveles de protones en los lisosomas. Por otra parte, estudios recientes sugieren LAMP-2 puede ser crítico en la comunicación entre los fagosomas y lisosomas, y en el receptor de la orientación para la maduración lisosoma 38 40. Por lo tanto, postulamos una lámpara-2 / lisosomal Inhibición modelo AMD biogénesis (Figura 9). En este modelo postulado, la inhibición lisosomal comienza con la modificación o degradación de la glycocalyx ligada a asparagina de LAMP-2. La eliminación de los resultados glycocalyx en rápida proteolisis de LAMP-2 41. El escudo glycocalyx podría modificarse lentamente o degrada con el tiempo por las proteasas potentes dentro del lumen lisosomales, tal vez como resultado del envejecimiento. Se requerirá más investigación para entender las causas de la ruptura de la glucocálix. Sin embargo, después de LAMP-2 se ha degradado, se produce un cambio de pH, la dineína ya no es capaz de tirar de los fagosomas maduros a los lisosomas o mala focalización de M6PR / Rab7 se produce 42. En consecuencia, el lisosoma es incapaz de degradar el material extra e intracelular por fusión fagolisosómico. Esto resulta en la acumulación de lipofuscina oxidado. La combinación del estrés oxidativo mitocondrial y la acumulación de senil, mitocondrias ineficiente y hierro en los lisosomas acelera aún más la acumulación de lipofuscina. Posible LAMP-2 / lisosomal Inhibición del modelo de la patogénesis de la DMAE. Una causa resultados desconocidos en la pérdida de la protección de glucocálix LAMP-2. La proteólisis de LAMP-2 se produce. La pérdida de los resultados de LAMP-2, ya sea 1) cambio de un pH y una pérdida de acidez del lisosoma, 2) dineína ya no se mueve fagosoma tarde para los microtúbulos centro de clasificación cerca de Golgi para la fusión con lisosomas o 3) la perturbación de M6PR reciclado / Rab tal que M6PR / Rab7 no etiqueta endosomas tardíos. La pérdida de la funcionalidad de los resultados M6PR / Rab7 en una falta de lisosoma-fusión fagosoma. Cualquiera de estos resultados en la pérdida de la capacidad de los lisosomas para degradar el material intra y extracelular. Posteriormente, el material no degradado se oxida, volviéndose a lipofuscina. En última instancia, la combinación de estrés oxidativo, la acumulación de Fe, mitocondrias seniles y la disminución en los resultados de ATP en rotación ineficiente de los orgánulos y el aumento de la inhibición de los lisosomas. muerte RPE desencadena fotorreceptor y la mácula muerte. En resumen, estos estudios demuestran dos nuevos hallazgos. En primer lugar, se muestran los cambios morfológicos en las células ARPE-19 debido a la cloroquina. Además, hemos demostrado que la disfunción lisosomal conduce a la acumulación de lípidos y sus subproductos en células ARPE-19 que puede simular la situación en la DMAE. Estos hallazgos parecen ser específicos para esta línea celular en particular, y que demuestran que a pesar de la dilatación lisosoma con tratamiento con cloroquina, esta acumulación de lípidos profusa no se ve con las células NIH 3T3 (Figura 4), neuroblastoma o líneas celulares de glioblastoma que hemos probado. Esta es quizás un reflejo de la intensa lisosomal / actividad autophagocytic de las células del EPR. Estas células pueden ser más susceptibles a las perturbaciones de los sistemas de degradación lisosomales y por tanto son un buen modelo para el estudio de los posibles mecanismos de AMD. Hay un interés despertado en la relación entre la inhibición lisosomal y AMD como se ve en la literatura reciente sobre la correlación entre la sobrecarga de hierro y la reducción de la actividad de CAT-D 43, la conversión de sustratos de proteasa de lisosomal inhibidores de la enzima sustrato 44 y la posible utilización de toxinas para elevar el pH bajo en ARPE lisosomas 45. Conclusiones Estos estudios demuestran la respuesta dependiente de la dosis y el tiempo de ARPE-19 a la cloroquina. Por otra parte, hemos demostrado que la cloroquina induce vacuolización y lípidos acumulación intracelular, e interrumpe la vía fagocítica. Nuestras observaciones parecen ser independientes del estrés oxidativo. mal funcionamiento lisosomal puede por lo tanto tienen un papel fundamental en la patogénesis de la AMD. Métodos Cell Growth Cultura Técnica células de cultivo de tejido humano ARPE-19 se obtuvieron de American Tissue Culture Center, Rockville, MD (ATCC, CRL-2502). Las células se hicieron crecer en Hams F12 Medio: DMEM (1: 1) (ATCC, 30-2006) con 10 suero fetal bovino (FBS) (ATCC, 30 a 2030) como monocapas a 37ºC con 5 CO 2 en 100 20 mm de cultivo ronda platos (Falcon, 35-3003). Células NIH / 3T3, células de fibroblastos de ratón embrionarias, también se obtuvieron de ATCC (CRL-1658) y se cultivaron en DMEM (ATCC, 30-2002) con 10 suero bovino de ternero (ATCC, 30 a 2030) en las mismas condiciones que las células ARPE . Las células se propagan por la división en una proporción de 1: 5 con una solución de tripsina-EDTA. Los estudios se realizaron tanto en ARPE-19 y células 3T3 durante los pasajes 5-15. Cloroquina La cloroquina se obtuvo de Sigma (C6628, St. Louis, MO). soluciones madre de cloroquina se realizaron a 10 mg / ml en agua doblemente desionizada, y se esterilizaron por filtración con un filtro de jeringa Acrodisc con una membrana de 0,2 m Tuffryn (Pall Life Sciences, Nueva York). Las alícuotas de las soluciones madre estériles se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Las cantidades apropiadas de solución madre fueron añadidos a los medios para alcanzar la concentración deseada. Para probar el efecto de la portadora, también se añadieron volúmenes equivalentes de agua estéril a un conjunto de células ARPE-19. Respuesta de células ARPE-19 a la cloroquina Aproximadamente 50.000 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (Falcon 35 a 3.043) y se cultivó a 50 de confluencia en cubreobjetos de vidrio estériles. Estos se incubaron con cloroquina a concentraciones de 0, 10, 20, 40, 80 y 100 g / ml durante 24 horas. En un conjunto separado de experimentos, las células se incubaron a 0, 40 y 80 g / ml durante 2 horas y 6 horas. Para demostrar que el portador no afectó a las células ARPE-19, agua estéril, en una cantidad equivalente a la de la portadora, se añadió a una serie por triplicado de células del EPR. Cada punto de la gráfica de la figura 1 representa siete experimentos independientes. La pérdida de células después de los distintos tratamientos de cloroquina se determinó contando las células en cubreobjetos. Para visualizar las células, se utilizó 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos celulares. Después del tratamiento designado, cubreobjetos se fijaron in situ en el 3,7 paraformaldehído. Los cubreobjetos se lavaron tres veces con fosfato 1X solución salina tamponada (PBS), y después una vez con PBS que contiene 1 g / ml DAPI y 0,1 saponina. Las células teñidas se visualizaron a través de un filtro DAPI con un objetivo 20 panfluorochrome con un microscopio BX50 de Olympus. Diez campos aleatorios de cada cubreobjetos se fotografiaron y se contaron. Cell kit de ensayo Ensayo de proliferación de MTT Un se obtuvo de Roche (11465007001). Aproximadamente 5.000 células fueron sembradas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, y se cultivaron a 50 de confluencia. tratamientos de cloroquina de 20, 30, 40, 50, 60, y 80 g / ml se administraron en 100 l de medio / pocillo, y las células se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Después de este primer período de incubación, se añadieron 10 l de reactivo de marcado MTT a cada pocillo, con lo que la concentración final de reactivo de marcado MTT a 10 mg / ml. Las células se incubaron durante 4 horas. En este punto, se añadieron 100 l de la solución de solubilización a cada pocillo, y la placa se incubó durante la noche. Después de este último periodo de incubación, se midió la absorbancia espectrofotométrica de las muestras usando un lector de ELISA. LAMP-2 anticuerpo monoclonal LAMP-2 y Cy2 secundaria anticuerpos anti-humano (anti-IgG de ratón 1) se obtuvo como sobrenadantes de tejidos de stock de hibridoma de los estudios de Desarrollo del Banco hibridoma (Universidad de Iowa) y se diluyó (1:50) en un 0,1 El suero bovino albúmina (BSA) /0.1 saponina / solución de PBS. se diluyó la cy2 de cabra-anti-ratón secundario o anticuerpo rodamina (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD) (1:60) con 0,1 BSA / 0,1 saponina / PBS. LAMP-2 tinción de inmunofluorescencia EPR y 3T3 células se tiñeron para LAMP-2 se ha descrito previamente 46. Neutral lípidos de la mancha de la HCS LipidTOX rojo neutro de lípidos de la mancha (Invitrogen, H34475) se diluyó 1: 4000 en PBS. Los cubreobjetos con LipidTOX se incubaron durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. entonces LipidTOX se retiró y las células se lavaron una vez con 1X PBS. Para probar LipidTOX especificidad, las células se lavaron con 0,1 Triton X-100 en PBS antes de la tinción con LipidTOX. células lavadas-X-100 Triton funcionaban como un control, que demuestra ninguna tinción con el LipidTOX. Epifluorescencia y Fase microscopía de contraste de una Olympus BX50 microscopio de contraste de fase con las capacidades y epifluorescentes, unido a una cámara digital Olympus DP11 o DP20, se utilizó para DAPI (20) imágenes. Esto también se utilizó para contraste de fase y estudios marcados con fluorescencia (60, inmersión en aceite). Las mitocondrias de tinción MitoTracker CMX Ros Red (Invitrogen, M7512) se disolvió en dimetil sulfóxido (DMSO Sigma) para lograr una concentración madre final de 1 mM. Las células fueron cultivadas a 50 de confluencia y se trataron con concentraciones de cloroquina de 10, 20 y 40 g / ml. Para la tinción de las mitocondrias, las células se incubaron durante 15 minutos a 37ºC en medio fresco con MitoTracker a una concentración de 300 nM, y después se fijaron con paraformaldehído al 3,7. Las células se lavaron en PBS tres veces 1, vistos con epifluorescencia, y se fotografiaron a lo descrito previamente. Golgi manchas Anti-golgin 97 IgG de ratón 1 (Invitrogen, 49363A) se disolvió en 1 PBS para crear una concentración final de 200 g / ml. Las células se incubaron con anti-golgin 97 y los anticuerpos LAMP-2, tanto diluyeron 1:50 en 0,1 BSA / 0,1 saponina / PBS. La tinción se visualizó con Golgi marcado con rodamina de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD). Las transferencias Western Blot Western se realizaron con modificaciones de LAMP-2 39. LAMP-2 se administró a una concentración de 1: 2000, seguido de incubación con anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con peroxidasa secundarios (BioRad, 1: 3000). Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron usando el kit de reactivo de quimioluminiscencia (Perkin-Elmer ECL). Los blots fueron despojados y luego probaron con la actina para funcionar como un control. H 2 0 2 Estudio de estrés oxidativo se diluyó una concentración de stock de 3 de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2. 0,88 M) en los medios de crecimiento para alcanzar concentraciones finales que variaban de 0,2 a 10 mM 28. Se incubaron las células tratadas durante 24 horas. Después de la incubación, las células se visualizaron por microscopía de contraste de fase y se tiñeron con LAMP-2, LipidTOX, Anti-golgin 97 y MitoTracker. dextrano El dextrano estudios de captación de rodamina conjugado, avg. 10.000 MW, se obtuvo de Invitrogen. Se preparó una solución madre de dextrano diluido en agua estéril, desionizada. Las células fueron cultivadas en diferentes concentraciones de cloroquina en cubreobjetos de vidrio redondos en placas de 24 pocillos durante 24 horas. Después de 24 horas de incubación, el medio se retira y se sustituye con nuevos medios que contienen la misma cantidad de cloroquina, así como un 0,05 mg / ml adicional de dextrano conjugado con rodamina. En este punto, las células se incubaron durante 6 horas, y después se fijaron en paraformaldehído al 3,7 en PBS. Las células se montaron en una solución de 10 glicerol-PBS, visualizaron y fotografiaron inmediatamente. Declaraciones Agradecimientos Agradecemos al Dr. Zhi-Gang, Xiong (Dow laboratorio de Neurobiología, Legado Holladay Parque Research Center, Portland, Oregon) útil para los debates y la asistencia técnica con la instrumentación y el Sr. Jeff Gadette (Oregón Episcopal School (OES), Portland, Oregon) por su asesoramiento en las estadísticas. Además, agradecemos al Dr. Robert Maue (Dartmouth College, Hanover, NH), el Dr. Bill Lamb (OES), Sr. Peter Langley (OES), y el Dr. Tanja Horvat (OES) para la crítica de este manuscrito. Se obtuvo financiación para este estudio en parte de subvenciones de la Fundación de Investigación de Oregon y Educación y el Fondo de Investigación Legacy Foundation. Autores archivos presentados originales de las imágenes A continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Dartmouth Referencias Buch H: incidencia, de catorce años de maculopatía relacionada con la edad y la prevalencia específica por causa de discapacidad visual y ceguera en una población caucásica: El estudio del ojo de la ciudad de Copenhague. Acta Ophtalmol. 2005, 83: 400-401. 10.1111 / j.1600-0420.2005.00474.x. Ver el artículo La Cour M, Kiilgaard JF, Nissen M: Relacionada con la edad degeneración macular: la epidemiología y el tratamiento óptimo. Envejecimiento drogas. 2002, 19: 101-133. 10.2165 / 00002512-200219020-00003 Ver artículo en PubMed Klein R: Visión general de los avances en la epidemiología de la degeneración macular relacionada con la edad. Oftálmica Epidemiol. 2007, 14: 184-187. 10.1080 / 09286580701344381. N Engl J Med. J Cell Biol. J Cell Biol. Invest Ophthalmol Vis Sci. Proc Natl Acad Sci EE. UU.. Vision Res. Invest Ophthalmol Vis Sci. Invest Ophthalmol Vis Sci. Curr Eye Res. Invest Ophthalmol Vis Sci. APMIS. Free Radic Biol Med. Naturaleza. Cell Mol Life Sci. Naturaleza. J Biol Chem. Naturaleza. Invest Ophthalmol Vis Sci. J Histochem Cytochem.